蜂胶中9种酚类化合物的高效液相色谱分析
蜜蜂网消息 蜂胶中9种酚类化合物的高效液相色谱分析 摘 要:建立了测定蜂胶中9种酚类物质含量的反相高效液相色谱法。色谱条件:色谱柱为ZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm,5.0μm),流动 相为甲醇-0.1%甲酸,梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1.0mL/min,检测波长为280、320和360nm。该方法准确、稳定、重现性好、加样 回收率高。 用此方法测定了我国不同产地蜂胶样品中9种酚类物质的含量。结果表明:不同产地蜂胶样品中9种酚类物质含量存在差别,极性较大的酚酸类化合物的含量差异较大。 关键词:蜂胶,高效液相色谱,黄酮类化合物,酚酸 蜂胶是蜜蜂从植物的叶芽与树皮上采集的树脂,由蜜蜂混入蜂蜡和上颚腺分泌物形成的胶状物质。制剂理研究表明:蜂胶具有抗细菌、消炎、提高机体免疫力、抗癌以及抗氧化等多种生物功能⑴,因此,蜂胶在保健食品和医 制剂行业中得到广泛的应用。已知蜂胶中含有150多种化合物⑵,其中具有生物活性的物质包括:酚酸类化合物、黄酮类化合物以及它们的衍生物,这些物质含量的 高低将直接影响到蜂胶产品的保健功能和内在质量。 中国虽然是世界蜂胶生产大国,但是对蜂胶活性含有的研究较少,尤其缺乏对其中生物活性含有定量分析方法学的研究。本文采用高效液相色谱.二极管阵列检测器串 联法,研究了中国蜂胶中酚类化合物的定量分析方法,同时测定了不同产地蜂胶样品中9种酚类化合物的含量。该研究结果对蜂胶产品的质量控制和蜂胶原料的标准 制定均有重要的参考价值。 1、材料与方法
1.1仪器和试剂 1.1.1仪器 HP1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司),包括四元梯度泵(G1311A)、二极管阵列检测器(G1315A);Milli2QG超纯水制备仪(美国Millipore公司)。 1.1.2试剂 甲 醇为色谱纯,水为超纯水,甲酸为分析纯。咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素和白杨素购自Sigma公司;山奈酚、芹菜素和高良姜素购自陕西 慧科植物开发有限公司,含量>95%。蜂胶样品分别采自陕西、河南、湖北、辽宁、贵州、山东、河北、浙江和甘肃等9个省份,每个省份采集5个蜂胶样品,并 按照SB/T10096-1992蜂胶标准进行鉴定。 2、实验方法 2.1蜂胶样品的处理方法 将采集到的蜂胶样品在-18℃冰箱中冷冻5h,然后用植物样品粉碎机粉碎至40目。 取 粉碎后的蜂胶样品5g,用50mL95%乙醇在常温下提取12h,滤纸过滤提取液,残渣再用50mL95%乙醇在常温下提取6h,合并2次提取 液,8000rpm离心10min。取上清液在40℃下减压回收乙醇,残渣在真空干燥箱中干燥,蒸发除去水分得蜂胶浸膏。称取50mg浸膏,用甲醇溶解并 定容至10mL,经0.45μm微膜过滤,移取10μL滤液用于色谱分析。 2.2对照品溶液的配置 称 取咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素对照品适量,用甲醇溶解并定容,摇匀,配得咖啡酸、ρ-香豆酸、反 式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素质量浓度分别为 0.052,0.051,0.056,0.065,0.12,0.15,0.13,0.16和0.12g/L的对照品溶液,作为储备液。其他不同浓度的各 对照品溶液由各自的储备液经甲醇稀释得到。 ZorbaxSB- C18色谱柱(150mm×4.6mm,5.0μm);柱温为30℃;流动相为甲醇-0.1%甲酸,梯度洗脱,其时间程序为 0min→30min→60min→70min→75min→80min,甲醇含量25%→55%→80%→95%→95%→25%,流速 1.0mL/min;二极管阵列检测波长为280、320和360mm,并进行190~400nm全波长扫描。 3、结果与讨论 3.1样品提取溶剂的选择 我 们曾研究了不同溶剂对蜂胶黄酮类化合物提取率的影响,结果发现,用乙醇作为溶剂时,总黄酮的提取率最高⑶。本文进一步考察了不同乙醇浓度对咖啡酸、ρ-香 豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、芹菜素、生松素、白杨素山奈酚和高良姜素提取率的影响,发现95%的乙醇对上述物质的提取率最高,故本实验以95%的乙醇作为 提取溶剂。 3.2色谱分离条件的优化 参考文献报道的色谱条件⑷~⑹,并根据这9种酚类化合物的性质,先后试验了不同比例的甲醇一水.甲酸作为流动相的等度洗脱以及各种梯度洗脱,并对色谱条件进行了优化。 实 验结果表明:仅用甲醇.水作流动相,酚类化合物不能得到很好的分离,色谱峰出现不同程度的拖尾。其主要原因是酚类化合物结构中的酚羟基发生了解离,造成其 在固定相表面上有双重的保留机制。随着流动相中加入甲酸后,抑制了酚羟基的解离,使酚类化合物在反相色谱条件下成为中性疏水缔合物,色谱峰的对称性增强。 考虑到色谱柱的耐酸性,本实验选用甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相,采用不同比例甲醇和0.1%甲酸水溶液梯度沈脱,在80min内可使蜂胶中大多数 含有达到较好的分离 图1蜂胶的色谱图 1.咖啡酸,2.ρ-香豆酸,3.阿魏酸,4.肉桂酸,5.山奈酚,6.芹菜素,7.生松素,8.白杨素,9.高良姜素 3.3线性关系考察 分 别移取一定体积的咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素各储备液于5mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,使咖 啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸和肉桂酸质量浓度范围为1.0~15.2mg/L,生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素质量浓度范围为 3.0~50.6mg/L。将上述混合对照品溶液分别平行测定3次,以平均峰面积у对被测物的质量浓度х(μg)进行线性回归。9种被测物质的回归方程和 相关系数见表1。 表1,9种酚酸的回归方程及相关系数 3.5精密度和稳定性实验 精密吸取蜂胶提取液10μL(产地:陕西秦岭),重复进样6次进行测定,咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜 素峰面积积分值的相对标准偏差(RSD)分别为2.12%,1.98%,1.65%,2.31%,1.92%,2.15%,1.75%,2.03%和 2.17%。 对陕西产的蜂胶提取液在8h之内每隔1h进行1次测定,考察供试品溶液的稳定性,8h内咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、 芹菜素和高良姜素的色谱峰面积积分值的RSD分别为2.32%,2.03%,2.17%,1.95%,2.62%,2.08%,2.83%,2.16%和 2.25%。 3.6加标回收率试验 准 确称取粉碎后的粗蜂胶粉末约100mg(产地:陕西秦岭),共5份,每份分别加入“1.2.2”项中各对照品储备液300μL,按“1.2.1”方法制备 蜂胶供试品溶液后进行测定。计算咖啡酸、ρ-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、生松素、白杨素、山奈酚、芹菜素和高良姜素的平均加标回收率(见表2)。 表2,9种酚酸的加标回收率(n=5)
组分 |
含量 |
加入量 |
检测量 |
回收率 |
RSD |
咖啡酸 |
100.9 |
15.6 |
115.3 |
99.1 |
2.16 |
ρ-香豆酸 |
43.3 |
15.3 |
59.8 |
102.0 |
2.03 |
阿魏酸 |
27.8 |
16.8 |
43.7 |
97.9 |
1.96 |
肉桂酸] |
24.5 |
19.5 |
44.1 |
l00.2 |
1.87 |
山奈酚 |
34.4 |
36 |
69.3 |
98.4 |
2.3l |
芹菜素 |
46.1 |
45 |
90.2 |
99.0 |
2.05 |
生松素 |
500.1 |
39 |
538.6 |
99.9 |
1.59 |
白杨素 |
573.5 |
48 |
622.7 |
100.2 |
2.16 |
高良姜素 |
372.4 |
36 |
407.3 |
99.7 |
1.79 |
3.7样品测定 按照“1.2.1”节方法制备蜂胶供试液,用此法对8个不同产地的蜂胶样品中8种酚类化合物的含量进行了测定,结果见表3。 表3不同产地蜂胶样品的酚酸含量(n=5)
组分含量(%) |
陕西 |
湖北 |
辽宁 |
贵州 |
山东] |
河北 |
浙江 |
甘肃 |
咖啡酸 |
0.06 |
0.51 |
0.68 |
0.46 |
0.12 |
0.31 |
0.56 |
0.03 |
ρ-香豆酸 |
0.07 |
0.25 |
0.41 |
0.08 |
0.35 |
0.34 |
0.28 |
0.03 |
阿魏酸 |
0.07 |
0.22 |
0.23 |
0.25 |
0.21 |
0.29 |
0.22 |
0.06 |
肉桂酸 |
0.14 |
0.19 |
0.24 |
0.28 |
0.19 |
0.29 |
0.13 |
0.22 |
山奈酚 |
0.06 |
0.28 |
0.27 |
0.39 |
0.02 |
0.36 |
0.42 |
0.3l |
芹菜索 |
0.26 |
0.37 |
0.37 |
0.49 |
0.12 |
0.46 |
0.47 |
0.55 |
生松素 |
2.12 |
2.01 |
2.45 |
2.51 |
2.05 |
2.18 |
2.14 |
1.85 |
白杨素 |
3.17 |
2.59 |
2.02 |
2.38 |
2.16 |
3.56 |
2.51 |
2.05 |
高良姜素 |
1.82 |
1.68 |
1.27 |
1.67 |
1.17 |
3.44 |
1.56 |
|
1.95 |
上一篇:蜂胶的标准化
下一篇:蜂胶作为保鲜膜的应用